WB实验全流程详解与优化指南

第一阶段：样品制备——成功的基石

样品来源与处理：
细胞样品： 贴壁细胞需用预冷的PBS轻柔洗涤后，直接加入裂解液刮取；悬浮细胞离心收集后洗涤，再行裂解。操作全程保持低温，防止蛋白降解。
组织样品： 取材后应立即液氮速冻，-80°C保存，研磨时需在液氮或低温研磨仪中进行，确保组织充分破碎且低温。

裂解液的选择与配制：
常用裂解液： RIPA裂解液适用于大多数可溶性蛋白；NP-40裂解液更为温和，利于保留蛋白质间互作；对于难溶蛋白（如膜蛋白、核蛋白），可选用更强效的裂解液（如含SDS）。
抑制剂添加： 必须新鲜加入蛋白酶抑制剂 cocktail 和磷酸酶抑制剂（如检测磷酸化蛋白）。建议将抑制剂配制成高浓度储存液，分装冻存，避免反复冻融。
裂解条件： 冰上裂解30min，期间可间歇涡旋，随后，4°C，12000-14000 g离心15min，取上清。
蛋白定量与变性：定量方法： BCA法因其抗干扰能力较强而被推荐，所有样品应使用同一标准曲线测定，确保数据可比性。
上样缓冲液： 使用含还原剂（如β-巯基乙醇或DTT）和SDS的Laemmli Buffer，加热变性是关键步骤：通常95-100°C加热5-10min。
上样量优化： 常规上样量为20-50 μg总蛋白。对于低丰度蛋白，可增加至80-100 μg；高丰度蛋白则可减少至10-20 μg，需通过预实验确定最佳上样量。

第二阶段：SDS-PAGE电泳——精密的分离
凝胶配制：
浓度选择： 根据目标蛋白分子量选择分离胶浓度，一般原则：6-8%胶用于>100 kDa蛋白；10%胶用于20-100 kDa蛋白；12-15%胶用于<20 kDa蛋白。梯度胶（如4-20%）适用于分子量分布广的样品。
制胶要点： 玻璃板需洁净；灌胶后及时用异丙醇或水压平界面；确保充分聚合（室温下至少静置45min）；新制胶可于4°C湿润保存过夜，使用效果更佳。

上样与电泳：
上样技巧： 使用平头微量进样器针头；将样品缓慢加至孔底；两侧孔加入预染蛋白Marker；空白孔加等体积1×上样缓冲液。
电泳条件： 采用恒压模式。浓缩胶阶段：80-90 V，约30min或至溴酚蓝进入分离胶。分 离胶阶段：根据胶浓度调整为110-150 V。电泳过程中需注意降温，尤其在夏天，可将电泳槽置于冰水浴中。
内参选择： 常用内参包括β-actin（42 kDa）、GAPDH（36 kDa）、Tubulin（55 kDa）等。建议根据实验体系和目标蛋白分子量选择合适的內参，有时需使用两个不同分子量的内参互为佐证。

第三阶段：蛋白质转膜——高效的迁移
转膜是将分离的蛋白质从凝胶原位转移至固相支持物（膜）上的关键步骤。
转膜方式选择：
湿转： 通用性强，尤其适合大分子量蛋白，转膜效率高，但耗时较长（常为90min以上），缓冲液用量大。
半干转： 快速（15-45min），缓冲液用量极少，但对“三明治”结构的平整度要求极高，且容易发热，较适合小分子量蛋白。

膜的选择与处理：
NC膜（硝酸纤维素膜）： 结合能力强，背景低，成本较低，但较脆，机械强度差。
PVDF膜： 机械强度高，可进行多次剥离（Strip）和重孵育，蛋白质结合容量大，但需在使用前用甲醇浸润激活。
膜的处理： 裁切膜的大小需略大于凝胶。PVDF膜在甲醇中浸泡15秒后，转入转膜缓冲液平衡。

“三明治”组装与转膜条件：
组装顺序（湿转，从正极到负极）： 海绵→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵。每一步都必须用玻璃棒或转印滚筒仔细赶走气泡，气泡是转膜失败的主要原因之一。
缓冲液： 湿转常用Towbin缓冲液（25 mM Tris, 192 mM甘氨酸，20%甲醇）。甲醇有助于蛋白与膜结合并防止凝胶膨胀，但会降低转膜效率，对大分子量蛋白可降至10%。
条件优化： 恒流转印。一般条件：250-300 mA，60-90min，置于冰浴或4°C冷房中。大分子量蛋白需更低电流、更长时间（如200 mA，过夜）。

第四阶段：免疫学检测——特异性的结合
封闭：
目的： 用非相关蛋白占据膜上未结合蛋白的空位，减少抗体非特异性吸附，降低背景。
封闭剂： 5% 脱脂奶粉（TBST配制）最为常用，成本低，但可能含有磷酸酶，影响磷酸化蛋白检测。5% BSA（牛血清蛋白）是检测磷酸化蛋白的首选，背景也更低。
条件： 室温摇床封闭1-2h，或4°C封闭过夜。

一抗孵育：
稀释： 严格按照抗体说明书推荐范围进行稀释，并使用含1% B特异性、低背景的结合。若时间紧迫，室温孵育2h亦可，但效果可能稍逊。
洗膜： 一抗孵育后，用TBST在室温摇床上洗涤3次，每次5min

二抗孵育：
选择： 根据一抗的种属来源选择对应的HRP（辣根过氧化物酶）或AP（碱性磷酸酶）标记的二抗，HRP-ECL发光系统最为普及。
稀释与孵育： 用封闭液或TBST稀释，室温摇床孵育1-2h。
洗膜： 用TBST在室温摇床上洗涤3次，每次5min，比一抗后洗涤更为关键，以彻底洗去未结合的二抗。

第五阶段：化学发光与成像分析——结果的呈现
化学发光：
底物配制： ECL发光液A液和B液按1:1比例混合，现用现配，均匀滴加在膜上，覆盖所有区域。
曝光： 在暗室或化学发光成像仪中进行,采用不同曝光时间多次采集图像，避免信号过饱和（条带中心发白）或曝光不足，可先进行短时间预览扫描。

图像分析：
软件： 使用ImageJ、Quantity One、Image Lab等软件进行分析。