酶联免疫吸附法(ELISA)由于其易于操作，可以简单地回答样本中有多少蛋白质/多肽/抗体这一基本问题，是科研中比较常用的一种检测方法。而这种简单的分析方法的核心，就是标准曲线。没有它，我们的实验就变成了一个二元的“是/不是”测试。有了它，我们可以深入研究生物反应的细节。那么，是什么使得标准曲线如此强大呢?让我们在ELISA的背景来讨论这个问题。

简单地说，标准品就是一系列已知目标蛋白数量的阳性对照。例如，如果对人类IgG进行ELISA检测，标准曲线将包含逐渐减少的已知量的人类IgG，它会让你立刻得出一系列的结论。

是否可以看到标准品的信号？如果可以，实验是好的；如果没有，就应该进行故障排除。也许抗体问题，或者系统中的其他东西没有得到优化。

这是一个比较棘手的问题。当标准浓度下降时，信号是否减少？如果答案是肯定的，那就是一个好的开始。如果答案是否定的，可能在某些步骤引入了一些背景，或者移液管可能需要校准。

一组适当的标准品总是以空白结束，在空白孔中不存在标准品。如果空白孔OD值为>0.1，说明可能引入了一些背景。

 

 

这是我们市场部同事在做实验培训时做的“人C反应蛋白(CRP)酶联免疫吸附检测试剂盒（ELK1040）”这个指标的标曲数据（新人已记不清上一次拿移液器是多少年前）。

 

 

 

用于免疫检测的所谓“标准曲线"其实称为拟合曲线比较合适。免疫检测时标准点（可以是倍比稀释的，也可以不是）浓度如果和相应的吸光度（OD）值如果能够呈现直线关系当然是最理想的了，这时可以通过Excel等方便的获得拟合曲线，进而推算出样品的浓度值。但我们做免疫检测很少有时候能够有这么理想的情况，标品浓度和相应OD值往往是"S"型的曲线关系，这时就不能用直线拟合的方式了，而对拟合方法进行选择就是必要的了。

关于标准曲线的拟合方式，直线、二次曲线、三次曲线、指数、对数等虽都可用于ELISA及其它生物学反应中的曲线拟合，但都只适用于曲线的一部分，有的适用于前半段，有的适用于后半段，有的适用于中间一段，而Logistic曲线则对曲线的全部都有较好的适用性。当然，如果用于定量，还是在中间一段较好。这些方法虽然没有一种方法可以通用，但也都可以用。关键在于你的标准曲线做到了S形的哪一部分，你想检测的样品浓度在曲线的哪一部分。在S曲线的低浓度部分可以用乘幂方程很好的拟合，中低浓度部分可以用直线方程，中间部分可用对数方程，而中后段可用四参数。

目前国际上普遍采用的免疫检测拟合方式是“四参数逻辑拟合"，用这种拟合方式往往能够比较的反映浓度和吸光度的曲线关系，从而进一步比较正确的获得样品中待测物质的浓度。其实，在一个长的区间内，Logistic应该都能拟合得较为理想。但并不是说它就是的。事实上不仅是ELISA，其它很多生物学反应都是S形曲 线，也都可以用Logistic曲线拟合。但建模型是一回事，而用它来定量是另一回事。如果用来定量，S形曲线的中间段（较陡处）是比较好的，而两端的平坦部分计算误差会大，有时甚至会很大。

二、做标准曲线样品检测时有几个问题需要注意

1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。

2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。

3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

4、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。

5、标准曲线的样品数一般为7个点（除去零孔、背景孔），但至少要保证有5个点）。

6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数R至少要大于0.90（至少要有一个九），对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999。