PCR、qPCR、RT-PCR、Real-time PCR区别浅析-科鹿（武汉）生物科技有限责任公司

技术专栏

PCR、qPCR、RT-PCR、Real-time PCR区别浅析

供稿：技术部

发布时间：2022-07-13

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PCR技术介绍：

聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）是在体外酶促扩增特定DNA片段的技术，由美国Kary Mullis及其同事于1985年发明。热稳定性Taq DNA聚合酶的应用和自动化装置的发明与完善，使PCR技术进入实用阶段。该技术的发明和广泛应用，大大推动了分子生物学各相关学科的发展，发明者也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

随着PCR技术的成熟，派生了不少相关技术。这类技术具有敏感、特异、快速和简单等优势，在微生物检验中的应用越来越广，不少国家将其纳入检验的标准方法；我国检验检疫领域对其应用也日益扩大，国家要求市级以上疾病预防控制中心具有PCR检测技术能力，用于突发公共卫生事件的快速检测和食品安全的有效监管等。

PCR技术的基本原理和DNA在体内天然复制过程相似，是在体外重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新DNA链的过程，只是整个过程在体外进行，而且反应体系比体内更简单。

1．体系组成和基本过程

（1）体系组成经典PCR以DNA为模板，体系组成包括原始模板、引物、原料、DNA聚合酶以及合适的盐、缓冲液以及温度循环参数等。原始模板是指长的双链DNA待扩增目的片段，微生物检验中往往是待测标本中的DNA。引物是两段单链寡核苷酸，其序列与待扩增片段的两端分别相同和互补。原料则是4种脱氧核苷三磷酸。

（2）基本过程PCR基本过程分为变性、退火和延伸三个阶段，经过多次循环实现目的片段的扩增。变性是指将反应体系混合物加热至93℃~95℃，维持较短的时间，一般30s，使待测的双链DNA在高温作用下变性，解链为2条单链DNA模板的过程。退火是指将反应体系混合物冷却至特定温度（也称退火温度）。延伸是指将反应体系的温度提高到72℃，在耐热DNA聚合酶作用下，以4种脱氧核苷三磷酸为原料，按碱基配对原则，合成与两条模板DNA互补的2条新的DNA链。

2．PCR技术的特点PCR技术显著的特点，决定了其无论在生物学相关领域的研究，还是在微生物检验方面，都具有很重要的地位。

（1）高灵敏度：产物量以指数方式增加，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平,能从100万个细胞中检出一个靶细胞等等。

（2）高特异性：以碱基配对原则使引物与模板DNA特异正确的结合、DNA聚合酶合成反应具有高度的忠实性、靶基因DNA具有高度特异性和保守性。

（3）方法简便和快速：一次性加好反应液，于DNA扩增仪进行变性-退火-延伸，2~4h完成扩增反应；而且扩增产物易分析、无放射性污染、易推广。特别是实时荧光定量PCR的发明和推广，可以通过电脑实时监控反应进程，不需要再对产物进行检测，大大缩短了实验时间。

（4）对样本的纯度要求低及适用范围广：PCR技术对样本的纯度要求低，DNA粗制品可作为扩增模板；不一定需要分离病毒、细菌或培养细胞；可直接用临床血液、体腔液、洗漱液、毛发、细胞、活组织等样本的粗制DNA扩增检测。适用范围非常广泛，不仅适合于微生物的快速检测，还可用于临床和法医等各方面。

PCR的过程大致可分为3步：变性—退火—延伸。

变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

如下图所示，在经历一次变性退火延伸的流程之后，原本只有1条的DNA双链变成了2条；2次之后是4条；以此类推，只要经历几十个循环数，就能产生大量的相同DNA片段。

PCR实验流程示意

MINOR HEAT

后续检测：

Endless Summer

以上就是常规PCR的正常流程。那在扩增完成之后我们需要对扩增出来的DNA进行检测，常规的PCR技术通常只能借助凝胶电泳手段。这里不对电泳技术做过多介绍，其是根据DNA的分子量大小不同对DNA进行分离，从而进行鉴定以及纯化DNA的技术。借助凝胶电泳可以判断扩增出来的DNA片段条带大小是否与目的条带大小一致，从而知道是否得到了想要的产物；看是否有杂带，判断扩增是否具有特异性；看是否有引物二聚体判断引物的设计好坏等等。

1关于qPCR和Real-time PCR：

很多人误以为RT-PCR是Real-time PCR的缩写，因此将二者混为一谈，但实际上是不一样的。

其实 Real-time-PCR 和 qPCR（Quantitative Rea-time-PCR）是一码事，都是实时定量 PCR，指的是PCR 过程中每个循环都有数据的实时记录，因此可以对起始模板数量进行精确的分析。

虽然 Real-time PCR（实时荧光定量 PCR）和 Reverse transcription PCR（反转录PCR）看起来都可以缩写为 RT-PCR，但是，国际上的约定俗成的是：RT-PCR 特指反转录 PCR，而 Real-time PCR一般缩写为 qPCR（quantitative real-time PCR）。在刚才介绍PCR后续检测方法的时候，我们说了通常只能借助凝胶电泳去分析产物，但实时荧光定量PCR借助荧光化学物质让我们在PCR的过程当中就可以检测到DNA的扩增情况，从而不需要再去跑电泳了，极大的简化了操作者的实验步骤。

qPCR的实验原理：

简单来讲，qPCR就是在整个扩增的过程中，引入了荧光基团，随着DNA数量的成倍增加，反应体系中的荧光信号也会增强。借助对荧光信号的强弱进行检测，从而对DNA扩增的情况进行定量分析。

目前根据不同的荧光物质，我们可以大致将qPCR分为两种。一种是用荧光染料，主要为SYBRGreenⅠ染料，该染料能与DNA双链结合，结合之后会显示荧光信号，而在没有结合的时候几乎检测不到荧光信号，随着拷贝数的增加，荧光信号增强。而还有一种是使用荧光探针，又叫TaqMan探针法，其原理是根据目的基因设计一个能与之特异性结合的荧光探针，该探针包含两个基团：一个荧光基团和一个淬灭基团，正常情况下因为淬灭基团的存在导致荧光基团无法发出荧光，而在扩增时探针结合到DNA的模板上，并且扩增到探针位置时两个基团被切开，从而荧光基团可以发出荧光，同样随着拷贝数的增加，荧光信号增强。

TaqMan探针法原理图

借助这种定量关系，人们可以绘制出PCR的扩增曲线，该曲线是荧光信号随着循环数变化而变化的曲线，借助该曲线就可以对PCR的情况进行分析，理想的曲线应该是呈现“S”型的增长，但是关于曲线分析的内容比较复杂，在这里暂时不做过多赘述。至少我们知道借助该技术我们可以不用在每次做完PCR之后去辛苦的跑电泳，也可以更精确的分析我们的PCR结果。因此该技术被越来越广泛的应用。

另外值得一提的是，在疫情当下，我们在做完核酸采样之后到底如何去判定被检者的阴性还是阳性，使用的便是qPCR技术，倘若在经过扩增一定循环数之后能检测到荧光信号，我们可认为被检者为阳性，反之则阴。

关于RT-PCR：

RT-PCR 就是逆转录 PCR（reverse transcription PCR）或者称反转录 PCR（reverse transcription-PCR, RT-PCR），是聚合酶链式反应（PCR）的一种广泛应用的变形。在 RT-PCR 中，一条 RNA链被逆转录成为互补 DNA，再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。首先我们要清楚什么是反转录，我们一般将遗传信息从DNA流向RNA的过程称为转录，反之，以RNA为模板合成DNA的过程我们称为反转录。该技术的一般过程为，首先以RNA为模板在反转录酶的作用下合成其对应cDNA，再以cDNA为模板进行普通的PCR过程。归根结底，其就是在PCR过程前加了一个反转录过程，那在这之后我们既可以用普通PCR手段，也可以采用qPCR进行扩增。比如病毒通常是以RNA为遗传物质，我们在进行病原体检测的时候只能提取到它的RNA，所以是需要进行反转录的。

其它的PCR技术：

其实除了以上介绍的几种PCR之外，现在还有数字PCR技术，也叫核酸分子绝对定量技术，相比于荧光定量，该技术更是对DNA数的绝对定量；以及巢式PCR等等。但其本质都离不开最开始说的PCR的三个步骤。

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