避坑指南：抗体选择的黄金法则

Western blot 的灵敏度和特异性取决于抗体的质量和使用抗体的实验条件。在使用含有血清和内源性免疫球蛋白的组织裂解液或组织培养上清液时，所选一抗的种属应有别于样本种属。例如，如果您研究的是小鼠蛋白，应选择在非小鼠的种属中培养的一抗（例如在兔中培养的一抗）。这是为了避免免疫球蛋白二抗与样本中的内源性免疫球蛋白发生交叉反应。使用不含内源性免疫球蛋白的样本时，一抗宿主种属的选择相对没那么严格。

为了使蛋白显色，需要选择一种可与一抗结合的（不同于一抗宿主种属的）二抗。使用酶联二抗，例如辣根过氧化物酶 (HRP) 偶联抗体或碱性磷酸酶 (AP) 偶联抗体，或者经Western blot 优化的荧光偶联抗体，可以提高灵敏度。记得确认偶联抗体的光发射波长是否与您的读数装置/扫描仪兼容。

与单独的一抗相比，偶联二抗的灵敏度更高，因为二抗可以在多个位点与一抗结合，从而增强信号。信号增强有利于检测复杂蛋白混合物中的目标蛋白，所以二抗非常适合用于 Western blot。